一、引言

细胞在体内并非处于静态环境，而是持续受到复杂的动态物理和化学信号调控。这些信号包括细胞外基质的降解与重塑、血流剪切、周期性拉伸、静水压等。近年来的研究表明，动态微环境对细胞行为具有显著影响，部分动态因素的影响甚至超越了传统静态基质因素（如模量、化学组成、拓扑结构等），因而也成为了组织工程与再生医学研究的新前沿。

在众多动态信号中，材料的降解过程已被广泛研究和关注。降解通常导致水凝胶逐渐软化和膨胀，进而影响干细胞的综合行为和分化路径。然而，丝素蛋白水凝胶（SFH）中还存在一种独特的动态微环境——蛋白构象转变微环境（Conformational transition microenvironment, CTM）。该过程由丝素蛋白分子从无规卷曲向β-折叠结构的自发转变所驱动，导致水凝胶逐渐硬化和收缩（图1A），与降解过程形成鲜明对比。该动态材料微环境具有可调控性且亦能对细胞行为产生显著影响，近年来成为生物材料研究的热点。

本文系统回顾了SFH中CTM的形成机制、表征方法、调控策略，以及其在干细胞行为调控、异位组织工程软骨构建、肿瘤抑制及功能材料开发等领域的应用进展，并提出了其未来的潜在研究和应用方向（图1B）。

图1 (A) Schematic presentation to show the dynamic conformational transition of proteins within SFH; (B) Summarized outlines to highlight the main contents of this review: the intrinsic mechanism, corresponding regulation strategies and induced dynamic material cues of the CTM and its existing and promising applications. Image (A) was modified with permission ^[54]. Copyright 2025, Oxford University Press.

[54] Cai GL, Zhao WK, Zhu TH, Oliveira AL, Yao X, Zhang YP. Effects of protein conformational transition accompanied with crosslinking density cues in silk fibroin hydrogels on the proliferation and chondrogenesis of encapsulated stem cells. Regener Biomater 2025;12:rbaf019.

二、丝素蛋白水凝胶的制备策略

2.1 物理交联法

SF分子由亲水和疏水链段交替组成。疏水链段富含重复多肽序列（如GAGAGS、GAGAGY），在适宜条件下可自发组装为β-折叠结构，形成物理交联点。物理交联条件温和，但凝胶时间相对较长，力学性能相对较弱。常见的物理交联诱导方式包括超声刺激、涡旋搅拌、电场刺激等。物理交联过程本质上是蛋白质构象转变的体现，有助于理解环境刺激对SF分子二级结构的影响。

2.2 化学交联法

化学交联通过形成共价键构建水凝胶网络，所得SFH具有更大的孔径、更好的弹性和力学性能，且更适用于三维细胞培养和活细胞包封。根据交联机制，可大体分为如下类别：（1）小分子交联剂交联。如利用戊二醛和京尼平进行交联。戊二醛与赖氨酸或酪氨酸的氨基/酚羟基反应。其毒性较高，在生物医用中需彻底去除。京尼平则为天然交联剂，毒性低，较适合生物医学应用。（2）酚羟基交联（形成二酪氨酸键）。利用SF分子中酪氨酸的酚羟基，在酶或光引发剂作用下形成二酪氨酸键。典型的引发体系包括辣根过氧化物酶/双氧水（HRP/H₂O₂）体系、三(2,2′-联吡啶)氯化钌(II)六水合物/过硫酸钠（Ru/SPS）体系、核黄素/过硫酸钠（RB/SPS）体系等。（3）碳-碳双键交联。先通过甲基丙烯酸酐修饰SF得到甲基丙烯酰化丝素蛋白（SFMA），在苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐（LAP）引发和紫外光照下交联。该策略适用于数字光处理3D打印，且保留构象转变能力。此外，SF还可与其他组分复配制备SF与其他聚合物的互穿网络水凝胶，以综合优化水凝胶的力学和生物学性能。

三、蛋白构象转变的内在机制与表征

3.1 机制分析

天然SF分子由亲水和疏水链段交替组成。疏水链段富含重复多肽序列（如GAGAGS、GAGAGY），在适宜条件下可自发组装为β-折叠结构。在化学交联SFH中，交联反应主要发生在亲水链段的活性官能团上，疏水链段得以完整保留并可自由运动。在生理条件下（体外细胞培养或体内植入），这些疏水链段可逐渐自组装形成热力学更稳定的β-折叠结构，驱动水凝胶中的蛋白分子发生构象转变。据此可分析总结出能发生显著构象转变的几个重要前提条件：（1）SF整体分子链足够长；（2）存在足够长度的可自由运动的疏水链段；（3）疏水链段的天然氨基酸序列未被明显破坏。

3.2 表征方法

SFH中的蛋白构象转变将促使材料的β-折叠含量、透明度、力学性能、内部孔径等材料特征发生动态变化，基于这些特征的表征可直接或间接反映相应的蛋白构象转变进程。针对β-折叠含量的变化，可采用FTIR光谱或硫黄素T荧光染色方法进行表征和评估。针对透明度的变化，可通过OD值变化或拍摄宏观照片进行追踪。针对力学性能变化，可通过力学测试设备进行压缩模量和强度的表征进行评估。针对孔结构变化，可通过SEM等手段表征材料剖面的孔径和孔隙率参数进行评估。上述特征参数的变化速率与构象转变速率呈正相关，因此可通过监测这些参数来评估CTM的动态特性。

四、调控构象转变快慢的策略

为了进一步深入研究CTM并实现其有效应用，研究者开发了多种有效调控策略。

4.1 改变复合组分含量

将SF与其他聚合物（如明胶、羧甲基纤维素、改性透明质酸）复合制备SF基复合水凝胶，通过调节SF占比来调控转变快慢。SF比例越高，转变越快；反之越慢。但该方法会同时改变材料的化学组成和初始力学性能等特征。

4.2 改变交联密度

通过改变水凝胶的重要合成参数调节SFH的化学交联密度。交联密度越低，可自由运动的疏水链段越长，分子运动与自组装越容易，构象转变越快；反之越慢。该方法可在保障单一SF原料（化学组成一致）的前提下调控蛋白构象转变快慢。

4.3 改变交联点均匀性

Ru/SPS体系与HRP/H₂O₂体系均通过二酪氨酸键交联成胶，但Ru分子小（~0.75 kDa），扩散快，反应迅速，易于形成高均匀性网络；HRP分子大（~44 kDa），扩散相对较慢，反应速度也相对缓慢。通过混合两种体系并调整比例，可在总交联密度相近的条件下获得不同交联点均匀度的水凝胶。低交联点均匀度水凝胶中含有部分“相对较长”的自由疏水链段，因而转变速率更快。该方法可在保障单一SF原料（化学组成一致）和等效交联密度的前提下调控蛋白构象转变快慢。

4.4 施加外部刺激

盐浴、甲醇、乙醇、水蒸气等可显著加速SF的构象转变，进而用于加快蛋白构象转变。虽然此类方法中的多数并不适用于活细胞包封研究，但他们可借助对蛋白构象转变的调控用于构筑高强度或微图案化的SF功能材料。

五、构象转变微环境的生物医学应用

5.1 调控细胞增殖

Mahajan等人制备了SF/明胶/羧甲基纤维素三元复合SCG水凝胶，发现SF比例越高，蛋白构象转变越快。相对而言，其研究中构象转变较慢的水凝胶更有利于干细胞的增殖。Cai等人通过调节交联密度获得不同蛋白构象转变速率的SFH，发现中等转变速率耦合其初始交联密度特征最利于包裹干细胞的增殖。进一步，Zhao等人通过调控交联点均匀度，制备了具有相同初始孔径和模量但蛋白构象转变速率不同的SFH。内部包裹细胞的增殖结果证实，较慢的构象转变速率更有利于细胞增殖。这很可能是因为较慢的转变可更长时间维持大孔径结构，促进营养与代谢物质交换。

5.2 调控细胞分化（尤其是成软骨分化）

在复合水凝胶（SCG系列）中，中等SF含量（50%）对应的中等转变速率能最大程度促进IFP-MSCs的成软骨分化，表现为Col II、SOX9、ACAN等基因的高表达。在HA-Tyr/SF复合水凝胶中，HA-Tyr20/SF80组在培养过程中压缩模量持续上升，软骨细胞表型维持最佳，蛋白聚糖和Col II沉积明显。在纯SFH体系中，无论通过交联密度或交联点均匀性调控，均一致发现：中等构象转变速率最能促进干细胞的成软骨分化。过慢或过快都会削弱分化效果。综上，这些跨策略、跨体系的研究结果均一致性提示适中的材料硬化/收缩过程可能模拟了天然软骨发育中的机械环境，极可能通过整合素-细胞骨架信号通路促进了干细胞的成软骨分化行为。

5.3 调控体内异位组织工程软骨构建

Mahajan等将包封髌下脂肪垫来源间充质干细胞（IFP-MSCs）的SCG-0（无转变）和SCG-50（中等转变速率）水凝胶植入裸鼠皮下。4周后，SCG-50组细胞呈球形，软骨ECM沉积（sGAG、Col II、聚集蛋白聚糖、硫酸软骨素）显著高于SCG-0组。这表明，适中的构象转变还可在体内促进异位组织工程软骨的构建。

5.4 调控肿瘤细胞行为

Ribeiro等将人胶质母细胞瘤细胞U251包封于SFH中。初期透明水凝胶支持细胞增殖；伴随急剧的蛋白构象转变，水凝胶发生强烈的硬化/收缩，出现TUNEL阳性凋亡细胞。类似结果在ATDC-5和HeLa细胞中也得到验证。在鸡胚绒毛尿囊膜模型中，发生急剧构象转变的SFH抑制了血管生成和肿瘤生长。因此，具有较快构象转变的SFH也有望作为一种可注射的肿瘤治疗系统，通过材料自身急剧动态变化诱导肿瘤细胞凋亡。

5.5 相关作用机制探讨

CTM调控细胞行为的可能机制包括：（1）孔径变化（逐渐减小）：促进细胞聚集与收缩，有利于成软骨分化，但过小则不利于细胞增殖与其他功能发挥；（2）模量变化（逐渐增强）：逐渐向天然软骨模量趋近，促进细胞黏附与成软骨分化；（3）动态机械刺激：持续硬化/收缩过程本身为细胞提供动态接触刺激信号，可能通过FAK-PI3K-Akt、MAPK、Wnt/β-catenin等通路传导发挥作用。但其中的具体机制和信号通路尚待进一步的研究和确认。

六、未来展望与挑战

尽管针对SFH中CTM的研究已取得重要进展，但目前仍处于起步阶段，未来可在以下方向开展深入研究：

更精准的构象转变调控：（1）提高原料SF的分子量与窄化其分子量分布。减少提取过程中的分子链断裂、窄化SF的分子量分布，有利于实现更有效、更精准的蛋白构象转变调控；（2）发展预测模型。基于实验数据建立构象转变动力学模型，指导材料设计和蛋白构象转变调控；（3）按需施加外部刺激。开发新型交联策略或智能响应性手段，实现时空可控的蛋白构象转变激活和调控。

揭示相关分子机制与信号通路：深入研究并明确CTM通过哪些信号通路影响细胞行为。已有线索指向整合素介导的机械转导通路，但缺乏直接证据。建议结合RNA测序、抑制剂阻断等技术开展系统研究进行证实。

加强体内实验评估：目前绝大部分研究为体外实验，未来需开展大动物模型的组织缺损修复研究。需要注意的是，构象转变伴随材料收缩，因此植入材料应预设计为较大尺寸，进一步经预培养至转变完成后再植入，以确保缺损填充效果。同时，体内转变速率可能与体外存在差异，需针对性优化设计。

构建高性能软骨类器官：现有类器官常用Matrigel、明胶等力学性能“较弱”的水凝胶材料，难以满足软骨等硬组织的力学仿生要求。SFH适中的硬化/收缩过程既能促进成软骨分化，又能提升基质力学性能，有望发展成为一类构建兼具功能和力学仿生软骨类器官的理想基质。

开发高透明且稳定的SFH：在角膜、隐形眼镜等应用中，需要抑制构象转变以维持水凝胶的透明度和尺寸稳定。潜在策略包括：提高交联密度和交联均匀性、对疏水链段进行化学修饰、与可阻碍β-折叠形成的共聚物复合等。

构筑超柔软或超硬的SF功能材料：通过调控构象转变进程和结晶结构的有序程度等，可获得模量从~30 MPa（超柔软薄膜）到~3 GPa（高强硬质材料）的SF功能材料。这些材料可用于柔性神经接口、硬质骨修复（骨板、骨钉）等领域。本综述中的相关机理和调控策略探讨为此类功能材料的设计和优化构筑提供了极具价值的理论指导和参考。

七、总结

本文系统综述了SFH中蛋白构象转变微环境的形成机制、调控策略与应用潜力。主要结论如下：构象转变是由SF分子中疏水链段的自发β-折叠形成所驱动，导致水凝胶发生动态硬化/收缩，形成与降解过程截然不同的动态材料微环境；可通过改变复合组分、交联密度、交联点均匀性及外部刺激来有效调控构象转变快慢；CTM可有效应用于细胞功能调控、组织工程软骨构建、肿瘤细胞凋亡诱导等领域，展示出广阔的生物医学应用前景；未来的核心研究和挑战包括精准控制构象转变、阐明其影响细胞功能的分子机制、推进体内验证、构建类器官、开发超柔软或超硬功能材料等。该综述首次系统性地提出并将SFH中的蛋白构象转变作为一种“独特的动态材料微环境”进行工程化设计与应用介绍，不仅深化了对动态材料微环境-细胞相互作用的认知和理解，也为设计新一代功能化蛋白基生物材料提供了较有价值的理论指导与实验依据。

课题组简介