东华大学张耀鹏研究员、姚响副研《Biomacromolecules》：丝素蛋白水凝胶的降解调控及其对干细胞增殖和分化的影响
生物支架材料可用于机体内组织缺损的有效修复。大量研究直接或间接证实，与新生组织生长速率匹配的支架材料降解速率可有效促进对应组织的再生效果。此外，少量前沿研究亦表明支架材料的动态降解进程对相关细胞行为同样具有重要的调控作用。由此可见，支架材料降解速率调控策略的开发在理想组织工程支架的构筑及应用中具有重要的地位和作用。丝素蛋白（Silk fibroin, SF）水凝胶作为一种普遍使用的细胞培养和缺损组织修复材料，关于其降解速率的有效调控及其降解快慢对细胞行为的影响规律却未见系统研究报道。
基于此，先进纤维材料全国重点实验室（东华大学）张耀鹏研究员、姚响副研究员团队设计并开发了一种巧妙的SF水凝胶降解速度调控策略，同时构筑了一系列具有初始特征等效、不同降解速率的丝素蛋白水凝胶。具体策略如下：首先构建球形度高、大小均匀且相当的常规丝素蛋白微球（不含蛋白酶，MSN）和载蛋白酶丝素蛋白微球（MSE）。随后通过改变两种微球的在SF水凝胶中的包裹比例，简便有效地调控SF水凝胶的降解速率（如图1A所示）。由于所包裹微球总量一致，且两种微球的形貌特征等效，因而可有效保障不同的SF水凝胶具有等效的初始特征。此外，从微球MSE释放出来的蛋白酶XIV可加快丝素蛋白材料的降解，因而添加MSE含量越高的SF水凝胶其降解速度越快。在成功构建相关材料平台的基础上，本研究进一步将骨髓间充质干细胞（MSCs）包裹至不同降解速率的水凝胶内部进行培养，进而全面考察并揭示了SF水凝胶的降解速率对所包裹干细胞增殖和成软骨分化的影响（如图1B所示意）。
图1丝素蛋白水凝胶降解快慢的调控原理示意图（A）以及丝素蛋白水凝胶降解快慢对其所包裹间充质干细胞增殖和成软骨分化影响的示意图。
具体而言，本研究采用相分离法成功制备了用于SF水凝胶降解速率调控的SF微球MSN和MSE。微球形貌表征结果表明，适宜载酶量（0.05 mg/mL）条件下制备获得的MSE具有与MSN等效的球形度和尺寸（图2A-C）。此外，MSE的 Zeta 电位与MSN相比显著向正方向偏移(图2D)。MSE在模拟细胞培养环境中孵育后的蛋白溶出量显著高于 MSN，这综合证明蛋白酶XIV被成功包裹至MSE内，且可顺利溶出。所述微球综合特征为后续具有等效初始特征、不同降解速率水凝胶材料平台的构筑提供了极大便利。
图2两种丝素蛋白微球的表征结果。（A）MSN的电镜图像；（B）MSE的电镜图象；（C）MSN与MSE粒径统计结果；（D）MSN与MSE的Zeta电位表征结果。 “Δ”: p > 0.05，比例尺为5 μm。
基于所制备的SF微球进一步构筑了不同的SF水凝胶。将所制备水凝胶命名为SFH-NxEy（水凝胶内部MSN和MSE质量比为x：y）。所制备5种水凝胶在模拟细胞培养环境中孵育后的质量损失结果表明，SFH-N10E0的质量损失最轻微、SFH-N0E10的损失最严重，丝素蛋白水凝胶的质量损失快慢与MSE的含量呈正相关关系，证明通过调节两种微球的用量比可以显著调控SF水凝胶的降解速率，相关水凝胶的降解速率由慢到快依次为：SFH-N10E0、SFH-N7E3、SFH-N5E5、SFH-N3E7、SFH-N0E10。随后进一步表征了SF水凝胶的降解快慢对材料孔径特征的影响（图4）。整体来看，降解越快，水凝胶中的网络结构被破坏的速度也越快，孔洞结构在初期会有一定的增大过程，最后会发生明显的坍塌。
图3不同丝素蛋白水凝胶在模拟细胞培养环境中的孵育不同时间的质量损失情况。
图4不同丝素蛋白水凝胶在模拟细胞培养环境中孵育不同时间后的孔洞结构变化情况。截面SEM图像上显示的数值为相应的孔径统计结果，比例尺为30 μm。
SF水凝胶的降解快慢亦会显著影响其力学性能参数（压缩模量和压缩断裂应变）的变化情况（图5）。总体来看，各组水凝胶的压缩力学性能初始等效，降解将导致水凝胶由初始的软弹状态转变为后期的硬脆状态，具体表现为压缩模量的上升和压缩断裂应变的下降。所述规律的变化快慢与水凝胶的降解速率呈正相关关系。在降解较快组别的后期，由于水凝胶网络结构的严重破坏和质量损失，SF水凝胶的压缩模量又会出现明显下降。
图5 不同丝素蛋白水凝胶在模拟细胞培养环境中孵育不同时间后的压缩力学性能变化情况。（A）压缩模量；（B）压缩断裂应变。
基于已构筑的具有等效初始特征、不同降解速率的SF水凝胶材料，本研究进一步全面考察并揭示了 SF 水凝胶的降解速率对材料内部包裹（三维培养环境）干细胞增殖和分化行为的影响。细胞培养7天的CTG（CellTiter-Glo）测试和活/死荧光染色结果综合表明（图6），具有中等降解速率的水凝胶（SFH-N5E5）内部细胞增殖最快，降解较慢或较快组别中细胞的增殖均有一定程度的下降，降解最慢的水凝胶（SFH-N10E0）内部细胞增殖最慢。细胞的成软骨特征性基因表达结果综合表明，培养7天后，具有适当降解速率的水凝胶（SFH-N7E3）中的细胞分化相对最强，随着降解速率的变慢或加快，其内部细胞的成软骨分化能力均有所下降，且降解最慢组别（SFH-N10E0）中的细胞分化略高于降解较快的组别（图7）。培养14天后，SFH-N10E0中细胞分化程度有所提高，达到与SFH-N7E3相近的水平，其余组仍保持相对较低的分化水平（图8）。
图6 丝素蛋白水凝胶的降解快慢对其内部包裹干细胞增殖的影响。（A）CTG染色后的发光度检测结果；（B）图A中的发光度变化率；（C）在典型水凝胶中培养7天后进行细胞活/死染色后的激光共聚焦显微照片。比例尺为100 μm。
图7 培养7天后，不同降解速率SF水凝胶中包裹MSCs的软骨特征性基因表达情况（其中D图为三种基因的综合表达趋势总结）。“Δ”: p > 0.05, “*”: 0.01 < p < 0.05, “**”: 0.001 < p < 0.01, “***”: p < 0.001。
图8 培养14天后，不同降解速率SF水凝胶中包裹MSCs的软骨特征性基因表达情况（其中D图为三种基因的综合表达趋势总结）。“Δ”: p > 0.05, “*”: 0.01 < p < 0.05, “**”: 0.001 < p < 0.01, “***”: p < 0.001。
此外，用HE和Safranin-O对培养7天和14天的典型水凝胶（SFH-N10E0、SFH-N7E3和SFH-N0E10）中的细胞进行免疫组织化学染色，结果如图9所示。其中，HE染色可以在一定程度上反映细胞总数。由于只有成软骨分化的细胞才可以被Safranin-O染成红色，因而Safranin-O染色可在一定程度上反应成软骨分化的细胞数量。7天的HE染色图像显示，细胞数量由少到多趋势为SFH-N0E10、SFH-N10E0、SFH-N7E3，这与图6A中的总细胞活力趋势一致。当培养14天后，SFH-N10E0和SFH-N7E3中的细胞数量高于SFH-N0E10。Safranin-O染色图像显示，培养7天后，SFH-N7E3中阳性染色细胞的比例高于SFH-N10E0和SFH-N0E10；培养14天后，SFH-N10E0和SFH-N7E3中阳性染色细胞的比例明显高于SFH-N7E3，上述结果与图7和图8所示的综合基因表达趋势较为吻合，进一步证实了SF水凝胶的降解快慢可以显著影响干细胞的增殖和成软骨分化。所述增殖和分化行为的影响是由材料降解带来的材料网络孔洞结构变化、压缩力学参数变化和动态的材料硬化因素综合所致。
图9 培养7天和14天后，典型水凝胶内细胞的免疫组织化学染色图像。比例尺为100 μm。
综上，本研究开发了一种便捷有效的SF水凝胶降解调控策略。在成功构筑具有等效初始特征、不同降解速率SF水凝胶材料平台的基础上，进一步在有效排除各类初始材料特征的基础上首次系统考察并揭示了SF水凝胶的降解速率对其内部包裹干细胞增殖和成软骨分化行为的影响规律。所述研究有望填补SF水凝胶降解速率这一动态材料微环境对干细胞行为影响认知的空白，从而为高效SF水凝胶软骨支架及其它类似生物材料的优化设计提供新的指导和参考。
近日，相关研究成果以题为“Effects of silk fibroin hydrogel degradation on the proliferation and chondrogenesis of encapsulated stem cells”发表在国际权威期刊Biomacromolecules上。论文第一作者为东华大学硕士生祝天浩，通讯作者为东华大学张耀鹏研究员和姚响副研究员。东华大学硕士生蔡国龙、赵伟焜为本论文共同作者。该工作得到了上海市科委国际合作项目、中央高校基本科研业务费自由探索项目和国家自然科学基金面上项目等项目支持。
原文信息与链接
Tianhao Zhu, Guolong Cai, Weikun Zhao, Xiang Yao*, Yaopeng Zhang*. Effects of Silk Fibroin Hydrogel Degradation on the Proliferation and Chondrogenesis of Encapsulated Stem Cells. Biomacromolecules, 2025, doi:10.1021/acs.biomac.4c01676.
https://doi.org/10.1021/acs.biomac.4c01676
