因创伤、衰老退化或先天性疾病等造成的软骨缺损在临床上极为常见。软骨缺损后由于其本身无血供而难以实现自我修复。传统治疗方法存在诸多不足，如二次创伤、并发炎症、免疫排斥等问题。组织工程可为软骨修复和再生提供新的治疗途径，是目前最具潜力的方法之一。软骨组织在生理状态下会受到多种动态力学因素的刺激，如静水压、剪切、压缩、拉伸等，这些力学刺激很可能在组织的发育、再生以及部分疾病的发生和治疗中扮演重要角色。与天然软骨相比，目前研究构建的组织工程软骨还存在机械性能差、均匀性差、特异性基质含量低等问题，这很可能是由组织工程软骨的体外培养条件与原生软骨微环境之间存在较大差异所致。因此，在体内外研究力学微环境对软骨组织重建和再生的影响具有重要临床价值。
东华大学纤维材料改性国家重点实验室张耀鹏教授、姚响副教授团队，基于丝素蛋白/细菌纤维素（RSF/BCNR）构建了复合软骨仿生支架，研究了阶梯状动态静水压刺激（DHP）对体外组织工程软骨构建的影响，以及机体动态负重微环境刺激对体内软骨缺损修复的影响（图1）。
图1. 基于RSF/BCNR复合软骨仿生支架研究力学刺激对体内外组织工程软骨再生的影响示意图。
该研究以具有优秀生物相容性的再生丝素蛋白（RSF）为基体材料，细菌纤维素纳米纤维束（BCNR）为增强体，采用酶促交联和冷冻干燥相结合的方法制备了一种有效的软骨仿生支架。结果表明，添加适量的BCNR后支架的孔径、力学性能和细胞相容性均得到了明显提升（图2和图3）。此复合支架为后续组织工程软骨的构建提供了一种较为适宜的材料模型。
图2. 支架的形态结构和力学性能。(a)SEM显示了RSF (6 wt% RSF) 和RSF/BCNR (6 wt% RSF 和 2 wt% BCNR 的复合, RSF: BCNR = 95:5)复合支架的多孔结构，插图是支架的外观图。(b)支架孔隙率的统计结果。(c)支架孔径的统计结果。(d)支架的抗压强度和杨氏模量。“Δ”：p > 0.05，“**”：0.001 < p < 0.01，“***”：p < 0.001。
图3. 在支架上培养1天、4天和7天后细胞的相对活力。“***”：p < 0.001。
为考察动态力学刺激对体外组织工程软骨重建的影响，研究者将软骨细胞-支架复合体分别置于传统静态培养条件（Static）和阶梯状动态静水压力刺激培养条件（DHP）下培养。从组织切片染色（图4）、生化定量分析和软骨特异性基因表达结果（图5）可知，与传统静态培养相比，DHP培养条件获得构建体中的软骨细胞数量和软骨特异性基质沉积更多，说明阶梯状动态静水压力刺激可有效促进软骨细胞的渗透、增殖和基质分泌，更利于体外功能性组织工程软骨的构建。
图4. 组织工程软骨在不同培养条件下的组织学染色照片。将软骨细胞接种在 RSF/BCNR支架上，并在Static和阶梯状DHP条件下培养14天。HE：苏木精-伊红染色；Safranin-O：番红-O染色（反映GAG的表达情况）；Col Ⅱ：Ⅱ型胶原免疫组化染色。红色箭头指示 RSF/BCNR 支架中的孔结构。
图5. 组织工程软骨在不同培养条件下培养21 天后的生化定量分析和 RT-PCR 结果。 (a) – (c)分别是DNA含量、GAG含量和Col Ⅱ含量。(d) - (f)分别是SOX9、Aggrecan和Col Ⅱ的相对基因表达。“**”：0.001 < p< 0.01，“***”：p < 0.001。
为进一步探讨复杂多样的体内力学微环境对软骨缺损修复的影响，研究者构建了兔膝关节负重区和非负重区的软骨缺损模型。支架植入8周后的大体观察结果（图6）表明，负重区缺损部位的新生组织具有更好的透明度和光滑度，新生组织与周围正常软骨组织极为相似。组织切片染色和软骨特异性基因表达结果（图7）也表明，体内的负重力学微环境更利于软骨缺损修复，负重区新生组织表层具有明显的软骨陷窝结构，结构致密，且细胞数量和软骨特异性基质沉积均明显多于非负重区对应的新生组织。
图6. 体内不同微环境部位的软骨缺损修复效果的大体形态观察。
图7. 术后8周不同体内微环境下再生软骨组织的组织学染色。红色箭头表示 RSF/BCNR 支架中残留的孔结构。
2022年3月，相关研究成果以题为Effects ofdynamic mechanical stimulations on the regeneration of in vitro and in vivocartilage tissue based on silk fibroin scaffold发表于Composites Part B: Engineering, 2022,235, 109764。论文第一作者为东华大学硕士研究生谷敏婧，共同通讯作者为东华大学张耀鹏教授和姚响副教授。东华大学范苏娜副教授、上海交通大学周广东教授、襄阳市中医医院马凯副主任医师为该论文共同作者。该工作获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金、上海市优秀学术带头人、上海市自然科学基金等项目的支持。
近年来，在动态微环境与细胞响应相关研究领域，张耀鹏、姚响课题组亦综合考察了流体剪切力复合超声刺激对干细胞增殖和成骨分化的影响（Regenerative Biomaterials, 2021, 8, rbab066）。相关研究结果表明，流体剪切力和超声刺激都能以强度依赖的方式明显地调控干细胞的行为。在适当的组合策略下，干细胞的增殖和成骨分化均能得到显著增强。上述相关研究成果对新型细胞生物反应器的设计、以及骨/软骨组织相关疾病的预防和治疗均具有重要的参考和指导意义。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359836822001470?via%3Dihub
