细胞外基质中的多种重要组分均为纤维状结构，如胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白等，它们为细胞的黏附、增殖、迁移和分化等行为提供了重要的生物和物理支撑。纤维状材料因其具有仿细胞外基质结构的特征，在生物医用材料领域具有广阔的应用前景，因而受到广泛关注。为了开发具有优异性能生物纤维材料，有必要准确揭示纤维固有特性（如直径及其排布特征等）对细胞行为的影响规律。已有研究借助静电纺丝技术考察并证实了纤维材料的“直径”和“取向排布”等对细胞行为的影响。然而，由于缺乏独特纤维材料平台的设计与构建，在此类细胞-纤维材料相互作用研究中存在明显的“背景黏附”干扰，如细胞透过纤维间空隙与基材材料（如细胞培养板）的黏附、细胞跨越邻近多根纤维间（包括上下和左右方位中的纤维）的黏附等，这些“背景黏附”易将多种影响因素混杂而干扰后续的细胞响应。
基于此，东华大学纤维材料改性国家重点实验室张耀鹏教授、姚响副教授团队设计并开发了一种具有抗细胞黏附反差特性的单层平行纤维图案。首先，利用寡聚乙二醇硅烷化试剂在玻片表面自组装接枝，制备具有优秀抗细胞黏附特性的基底材料；随后以聚己内酯纤维为模型材料，结合静电纺丝、干法纺丝和湿法纺丝技术在基底表面制备不同直径且可黏附细胞的单层平行纤维，最后借助生物相容性良好的聚二甲基硅氧烷（PDMS）将纤维两端固定，从而制备了具有强烈抗细胞黏附反差特性的单层平行纤维图案。此类纤维图案可以在指定的疏密排布情况下可控地排除所述“背景黏附”的干扰，进而为准确揭示纤维固有特征对细胞行为的影响提供强有力的材料平台（图1）。
图1 基于具有抗细胞黏附反差特性的单层平行纤维图案研究纤维直径对干细胞行为影响的示意图
基于上述纤维材料平台，本研究考察了纤维直径及其疏密排布特征对骨髓基质干细胞（MSCs）黏附、增殖和成骨分化的影响。其中细胞在稀疏排布图案上的黏附增殖情况可准确反映单一纤维直径因素对细胞黏附增殖行为的影响。结果表明：SA-D1组（稀疏排布，纤维平均直径1 μm）细小的纤维直径严重限制了细胞的黏附，细胞呈串珠状排列，长径比小、增殖率最低；SA-D8组（平均直径8 μm）中适宜的纤维直径可引导细胞呈单列排布、长径比高，细胞增殖率较SA-D1也有明显提升；而SA-D50组（平均直径50 μm）的纤维尺寸可支持细胞向纤维径向或其他方向伸展黏附，长径比较SA-D8有所降低，细胞的增殖率与SA-D8相当（图2和图3）。细胞在密集排布图案上的黏附增殖情况表明：在存在左右邻近纤维间跨越黏附的情况下纤维直径对于细胞黏附增殖行为的影响。结果表明：DA-D1组（密集排布，纤维平均直径1 μm）细胞在黏附早期就极易出现跨越现象，长径比较低，呈星形黏附铺展状，细胞增殖率明显提升，达到与DA-D8组（平均直径8 μm）和DA-D50组（平均直径50 μm）类似的水平；DA-D8及DA-D50组纤维图案上的细胞仍然更倾向于在单根纤维上黏附，细胞黏附铺展状态与稀疏图案类似，因而增殖率情况在DA-D1、DA-D8和DA-D50间差异不大（图4和图5）。
图2 干细胞在稀疏排布纤维图案上培养12 h后的黏附情况。（a）纤维图案示意图及对应黏附细胞的骨架和细胞核的荧光染色照片；（b）细胞的SEM照片
图3 干细胞在稀疏排布纤维图案上培养60 h后的增殖情况。（a）细胞的增殖示意图；（b）根据细胞密度的变化计算细胞增殖速率的公式；（c）细胞增殖率的统计结果。“Δ”: p > 0.05，“***”: p < 0.001
图4 干细胞在密集排布纤维图案上培养12 h后的黏附情况。（a）纤维图案示意图及对应黏附细胞的骨架和细胞核的荧光染色照片；（b）细胞的SEM照片
图5 干细胞在密集排布纤维图案上培养60 h后的增殖情况。（a）细胞的增殖示意图；（b）根据细胞密度的变化计算细胞增殖速率的公式；（c）细胞增殖率的统计结果. “Δ”: p > 0.05
图6 干细胞在稀疏排布纤维图案上培养4天后的成骨特征性基因表达情况。“Δ”: p > 0.05，“*”: 0.01< p< 0.05，“***”: p < 0.001
为进一步探讨纤维直径及其疏密排布特征对细胞成骨分化的影响，本研究还表征了细胞在纤维图案上培养4天后的成骨特征性基因（ALP、Col Ⅰ、OPN、Runx2）的表达情况。其中细胞在稀疏排布图案上的分化情况可准确反映单一纤维直径因素对细胞分化行为的影响。结果表明：SA-D8组纤维尺寸能够显著促进细胞的成骨基因表达；而SA-D1组由于纤维直径的严重限制导致了细胞的黏附及活力均不佳，因而成骨能力最差；SA-D50组纤维图案上的细胞受铺展面积及细胞间接触程度的综合影响，成骨基因表达低于SA-D8组，高于SA-D1组（图6）。细胞在密集排布图案上的分化情况反映：在存在左右邻近纤维间跨越黏附的情况下纤维直径对于细胞分化行为的影响。结果表明：在DA-D1中，由于纤维间的跨越黏附，细胞的黏附铺展和增殖均得到显著改善，且这一细小纤维间的跨越黏附极可能增强了细胞的内应力，因而体现出了最高的成骨基因表达。由于DA-D8组后期细胞也逐渐体现出部分跨越纤维间黏附的现象，因此其与DA-D50组具有类似的成骨基因表达水平（图7）。
图7 干细胞在密集排布纤维图案上培养4天后的成骨特征性基因表达情况。“Δ”: p > 0.05，“***”: p < 0.001
对比稀疏及密集排布情况下纤维直径对细胞黏附、增殖及成骨分化的影响，可以发现两种排布下的影响规律和趋势显著不同（图8）。主要原因很可能在于密集排布的纤维图案中混杂了细胞在左右临近纤维间的“跨越黏附”，进而影响了细胞黏附及其后续的增殖和分化行为。通过比较稀疏排布和密集排布两种形式图案的结果，可以更为全面和准确地理解细胞-纤维材料相互作用中各因素的交互作用规律。
图8 在稀疏和密集排布情况下纤维直径对细胞行为影响规律总结。（a）细胞增殖情况；（b）细胞成骨分化情况
综上，本研究设计并成功构筑了具有优异抗细胞黏附反差特性的单层平行纤维图案，进一步在可控排除各类“背景黏附”干扰的基础上揭示了纤维直径及其疏密排布特征对细胞黏附、增殖和成骨分化的影响规律，证实了在有无纤维间跨越黏附干扰情况下得出的纤维直径对细胞行为的影响规律显著不同，同时也明确了纤维直径本身和纤维间的跨越黏附对细胞行为的具体调控作用。相关研究为准确揭示细胞-纤维材料相互作用规律构建了有效平台，也为新型、高效生物纤维材料的开发和利用提供了重要的借鉴。
近日，相关研究成果以题为Fiber diameters and parallel patterns: Proliferation and osteogenesis of stem cells发表在中国生物材料学会会刊Regenerative Biomaterials期刊上。论文第一作者为东华大学硕士生顾张弘，通讯作者为东华大学张耀鹏教授和姚响副教授。东华大学范苏娜副教授与葡萄牙米尼奥大学Subhas C. Kundu教授为共同作者。该工作得到了上海市自然科学基金、中央高校基本科研业务费和国家自然科学基金等经费的大力支持。
原文信息与链接：
Gu ZH, Fan SN, Kundu SC, Yao X*, Zhang YP*. Fiber diameters and parallel patterns: Proliferation and osteogenesis of stem cells. Regen. Biomater., 2023; 10: rbad001.
https://academic.oup.com/rb/article/doi/10.1093/rb/rbad001/6986133
